|
|
Noncanonical human eIF4Es in and out of the RNA granules
Frydrýšková, Klára ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Půta, František (oponent) ; Valášek, Leoš (oponent)
Eukaryontní translační iniciační faktor eIF4E1 řídí iniciaci translace závislou na čepičce, vyskytuje se v P-tělíscích a je důležitý pro vznik stresových granulí (SG). V lidských buňkách jsou obsaženy také dva další nekanonické translační iniciační faktory, eIF4E2 a eIF4E3. Oba váží čepičku, ačkoliv slaběji než eIF4E1. V rámci této práce jsem se zabývala schopností jednotlivých členů z rodiny proteinů eIF4E a jejich variant lokalizovat do stresových granulí a P-tělísek za klidových podmínek a za podmínek tepelného a arsenitanového stresu. Za všech testovaných podmínek lokalizovaly proteiny eIF4E1 a eIF4E2 a všechny jejich testované varianty do P-tělísek na rozdíl od variant proteinu eIF4E3. Za obou stresových podmínek všechny varianty proteinu eIF4E1 a varianta eIF4E3-A lokalizovaly do SG, avšak schopnost jednotlivých proteinů lokalizovat do SG se lišila. Protein eIF4E2 lokalizoval ve zvýšené míře pouze do SG vyvolaných tepelným stresem. Při detailnějším studiu jsme ukázali, že za tepelného stresu vznikají dva typy SG ve vztahu k eIF4E proteinům. Přibližně 75 % SG indukovaných tepelným stresem obsahuje všechny tři eIF4E proteiny, zatímco ve 25 % z nich protein eIF4E2 chybí. Dále jsme ukázali, že protein velké ribosomální podjednotky L22 je specificky nabohacen v SG vyvolaných arsenitanovým stresem....
|
|
|
Translation reinitiation mechanism on mRNA of trascriptional activator GCN4.
Vlčková, Vladislava ; Valášek, Leoš (vedoucí práce) ; Strachotová, Dita (oponent)
Translační reiniciace je genově specifický mechanismus kontroly translace, který využívá schopnosti něktrých krátkých otevřených čtecích rámců (uORFs) předcházejících v mRNA hlavní otevřený čtecí rámec zadržet 40S ribosomální podjednotku na mRNA poté, co ribosom na tomto uORF translaci ukončil. Efektivita tohoto procesu je ovlivněna tím, jaké nukleotidové sekvence uORF obklopují a jak rychle je ribosomem překládán, zdali jsou přítomny vybrané iniciační faktory, a také vzdáleností tohoto uORF od hlavního otevřeného čtecího rámce. Přestože přesný mechanismus reiniciace není dosud zcela znám, v posledních letech byly některé jeho dílčí kroky objasněny za pomoci studia mechanismu translační kontroly genu GCN4. Ukázalo se například, že naprosto nezbytná pro tento proces je účast eIF3. eIF3 specificky interaguje s mRNA sekvencí předcházející uORF, a tím významně napomáhá zadržení 40S podjednotky na mRNA a následné reiniciaci. Cílem této práce je shrnutí současných poznatků týkajících se mechanismu reiniciace translace. Jako příklad byl zvolen kvasinkový transkripční aktivátor GCN4, translace jehož mRNA je přísně řízena právě mechanismem reiniciace.
|
|
|
Studium a podjednotky lidského translačního iniciačního faktoru 3 (eIF3) metodou RNA interference.
Peclinovská, Lucie ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Martínková, Markéta (oponent)
Iniciace translace je klíčovým krokem proteosyntézy, který umožňuje regulaci genové exprese. Regulace na úrovni přepisu mRNA je nejrychlejším možným mechanismem. Celý proces je ovlivňován mnoha iniciačními faktory. Jedním z eukaryotických iniciačních faktorů, který participuje na celé řadě procesů během iniciace translace je eIF3. Za jeho velice efektivní, a pro iniciaci translace nezbytnou, alespoň v kvasinkách, byla označena největší podjednotka p170, též nazývaná eIF3a. Tato práce si klade za cíl, utvořit komplexní náhled na eIF3a, přičemž hodlá vycházet z poznatků nabytých sledováním této podjednotky v Saccharomyces cerevisiae. Snížení exprese eIF3a, které umožňuje pozorovat vliv této podjednotky pomocí různých experimentů v porovnání s kontrolní skupinou, je "navozeno" metodou RNA interference. Na eIF3a je zde nahlíženo z pohledu i) životaschopnosti buněk metodou využívající 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyl- -tetrazolium bromid (MTT testu) ; ii) sleduje se vliv podjednotky na celkovou expresi proteinu inkorporací 35 S-methioninu a iii) v neposlední ředě je v této práci ukázán vliv snížené exprese eIF3a na tvorbu polysomů.
|
|
|
The role of translation initiation factor 3 (eIF3) in translation termination.
Beznosková, Petra ; Valášek, Leoš (vedoucí práce) ; Krásný, Libor (oponent) ; Staněk, David (oponent)
Syntéza proteinů v buňce je velmi regulovaný proces během genové exprese. Každý gen má svůj vlastní začátek a též jeden konec, který je určován přítomností jednoho ze tří stop kodónů. Mnoho součastných článků popisuje ribosomy, které záměrně přechází přes stop signál u některých vybraných mRNA, aby prodloužily vznikající polypeptid a změnily jeho vlastnosti. Tento regulační proces se nazývá programované pročítání stop kodónu. Výzkum této regulace má potenciál se uplatnit i v lékařství, neboť přibližně 15% všech dědičných chorob je způsobeno přítomností takzvaného předčasného terminačního kodónu (PTC), který zastaví translaci a vznikne tak zkrácený nefunkční protein. Mnohé laboratoře již hledají netoxické látky, které by zvyšovaly pročítání předčasného terminačního kodónu. Bohužel k úspěšnému naplnění jejich záměru je třeba identifikovat a porozumět všem faktorům, které tento process ovlivňují. V této disertační práci představujeme jeden takový faktor- eukaryotický iniciační faktor 3 (eIF3). Demonstrujeme jeho schopnost indukovat pročítání terminačních kodónů, které jsou v kontextu nukleotidů nevhodných pro efektivní terminaci. Taktéž jsme vytvořili analýzu "nearcognate" tRNA a ukázali, jak jsou inkorporovány na stop kodón, za kterým následují různé nukleotidy. Díky tomu jsme byli schopni rozšířit...
|
|
|
The role of translation initiation factor 3 (eIF3) in translation termination.
Beznosková, Petra
Syntéza proteinů v buňce je velmi regulovaný proces během genové exprese. Každý gen má svůj vlastní začátek a též jeden konec, který je určován přítomností jednoho ze tří stop kodónů. Mnoho součastných článků popisuje ribosomy, které záměrně přechází přes stop signál u některých vybraných mRNA, aby prodloužily vznikající polypeptid a změnily jeho vlastnosti. Tento regulační proces se nazývá programované pročítání stop kodónu. Výzkum této regulace má potenciál se uplatnit i v lékařství, neboť přibližně 15% všech dědičných chorob je způsobeno přítomností takzvaného předčasného terminačního kodónu (PTC), který zastaví translaci a vznikne tak zkrácený nefunkční protein. Mnohé laboratoře již hledají netoxické látky, které by zvyšovaly pročítání předčasného terminačního kodónu. Bohužel k úspěšnému naplnění jejich záměru je třeba identifikovat a porozumět všem faktorům, které tento process ovlivňují. V této disertační práci představujeme jeden takový faktor- eukaryotický iniciační faktor 3 (eIF3). Demonstrujeme jeho schopnost indukovat pročítání terminačních kodónů, které jsou v kontextu nukleotidů nevhodných pro efektivní terminaci. Taktéž jsme vytvořili analýzu "nearcognate" tRNA a ukázali, jak jsou inkorporovány na stop kodón, za kterým následují různé nukleotidy. Díky tomu jsme byli schopni rozšířit...
|
|
|
Binding of eIF3 in complex with eIF5 and eIF1 to the 40S ribosomal subunit is accompanied by dramatic structural changes
Zeman, Jakub
Eukaryotické iniciační faktory (eIF) jsou pro průběh eukaryotické translace minimálně stejně důležité jako ribosom. Některé tyto faktory mají rozdílné úlohy napříč celou translací v zajištění korektního složení preiniciačního komplexu na mRNA, přesném výběru iniciačního kodonu, bezchybné produkci příslušného polypeptidu a jejím řádném ukončení. Patrně nejdůležitějším z těchto faktorů je eIF3, který integruje signály od ostatních faktorů a koordinuje jejich funkci na ribosomu. V případě Saccharomyces cerevisiae je eIF3 tvořen pěti podjednotkami. Všechny tyto podjednotky obsahují strukturní motivy zodpovědné za kontakt s ribosomálními proteiny a molekulami RNA. Kromě těchto vysoce strukturovaných částí je zbytek eIF3 nestrukturovaný a velmi flexibilní. Z toho důvodu nejsou i přes současný pokrok v kryoelektronové mikroskopii doposud známy ani přesná struktura eIF3, ani jeho přesná poloha na ribosomální podjednotce 40S. Rovněž přítomnost eIF3 na ribosomu 80S během časné elongace a role eIF3 v reiniciaci a pročítání stop kodonu nejsou zatím zcela prostudovány. K rozluštění těchto tajemství eIF3 jsme použili rentgenovou krystalografii, chemické zesítění spojené s hmotnostní spektrometrií a rozličné biochemické a genetické metody. Naše práce ukazuje, že je eIF3 velmi kompaktně sbalený, pokud se nachází...
|
|
|
The role of elF3 a Rps3 in stop codon readthrough
Poncová, Kristýna ; Valášek, Leoš (vedoucí práce) ; Vopálenský, Václav (oponent) ; Krásný, Libor (oponent)
Translace představuje složitě regulovaný a vysoce provázaný proces výroby proteinů v buňce. Má několik základních fází-iniciaci, elongaci, terminaci a recyklaci ribosomů. Naše laboratoř se zabývá studiem multifaktoriálního komplexu eukaryotického iniciačního faktoru 3 (eIF3). Zajímá nás nejen odhalování jeho molekulárních rolí v průběhu translačního cyklu, ale také jeho úloha při specifických mechanismech, které se podílí na regulování translace v závislosti na buněčných potřebách. eIF3 se skládá v kvasinkách z pěti esenciálních podjednotek (a/Tif32, b/Prt1, c/Nip1, g/Tif35 a i/Tif34). V savcích je jeho složení komplexnější s 12 podjednotkami (a-i, k-m). eIF3 je klíčový hráč nejen v iniciaci translace, ale také ve fázi recyklace ribosomů a překvapivě i v translační terminaci a pročítání stop kodonu. Posledně zmiňovaný proces má velký klinický potenciál, jelikož téměř 1/3 geneticky podmíněných onemocnění je způsobena přítomností předčasného terminačního kodonu v protein kódující oblasti. Porozumění molekulárním detailům pročítání stop kodonu a translačně terminační mašinérie je důležité pro další vývoj selektivních a méně toxických léčiv vhodných k terapii. V této disertační práci jsem popsala jak protein malé ribosomální podjednotky Rps3 řídí efektivitu rozpoznávání stop kodonu. Identifikovala jsem...
|
|
|
Noncanonical human eIF4Es in and out of the RNA granules
Frydrýšková, Klára ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Půta, František (oponent) ; Valášek, Leoš (oponent)
Eukaryontní translační iniciační faktor eIF4E1 řídí iniciaci translace závislou na čepičce, vyskytuje se v P-tělíscích a je důležitý pro vznik stresových granulí (SG). V lidských buňkách jsou obsaženy také dva další nekanonické translační iniciační faktory, eIF4E2 a eIF4E3. Oba váží čepičku, ačkoliv slaběji než eIF4E1. V rámci této práce jsem se zabývala schopností jednotlivých členů z rodiny proteinů eIF4E a jejich variant lokalizovat do stresových granulí a P-tělísek za klidových podmínek a za podmínek tepelného a arsenitanového stresu. Za všech testovaných podmínek lokalizovaly proteiny eIF4E1 a eIF4E2 a všechny jejich testované varianty do P-tělísek na rozdíl od variant proteinu eIF4E3. Za obou stresových podmínek všechny varianty proteinu eIF4E1 a varianta eIF4E3-A lokalizovaly do SG, avšak schopnost jednotlivých proteinů lokalizovat do SG se lišila. Protein eIF4E2 lokalizoval ve zvýšené míře pouze do SG vyvolaných tepelným stresem. Při detailnějším studiu jsme ukázali, že za tepelného stresu vznikají dva typy SG ve vztahu k eIF4E proteinům. Přibližně 75 % SG indukovaných tepelným stresem obsahuje všechny tři eIF4E proteiny, zatímco ve 25 % z nich protein eIF4E2 chybí. Dále jsme ukázali, že protein velké ribosomální podjednotky L22 je specificky nabohacen v SG vyvolaných arsenitanovým stresem....
|
|
|
Binding of eIF3 in complex with eIF5 and eIF1 to the 40S ribosomal subunit is accompanied by dramatic structural changes
Zeman, Jakub
Eukaryotické iniciační faktory (eIF) jsou pro průběh eukaryotické translace minimálně stejně důležité jako ribosom. Některé tyto faktory mají rozdílné úlohy napříč celou translací v zajištění korektního složení preiniciačního komplexu na mRNA, přesném výběru iniciačního kodonu, bezchybné produkci příslušného polypeptidu a jejím řádném ukončení. Patrně nejdůležitějším z těchto faktorů je eIF3, který integruje signály od ostatních faktorů a koordinuje jejich funkci na ribosomu. V případě Saccharomyces cerevisiae je eIF3 tvořen pěti podjednotkami. Všechny tyto podjednotky obsahují strukturní motivy zodpovědné za kontakt s ribosomálními proteiny a molekulami RNA. Kromě těchto vysoce strukturovaných částí je zbytek eIF3 nestrukturovaný a velmi flexibilní. Z toho důvodu nejsou i přes současný pokrok v kryoelektronové mikroskopii doposud známy ani přesná struktura eIF3, ani jeho přesná poloha na ribosomální podjednotce 40S. Rovněž přítomnost eIF3 na ribosomu 80S během časné elongace a role eIF3 v reiniciaci a pročítání stop kodonu nejsou zatím zcela prostudovány. K rozluštění těchto tajemství eIF3 jsme použili rentgenovou krystalografii, chemické zesítění spojené s hmotnostní spektrometrií a rozličné biochemické a genetické metody. Naše práce ukazuje, že je eIF3 velmi kompaktně sbalený, pokud se nachází...
|
|
|
The role of translation initiation factor 3 (eIF3) in translation termination.
Beznosková, Petra
Syntéza proteinů v buňce je velmi regulovaný proces během genové exprese. Každý gen má svůj vlastní začátek a též jeden konec, který je určován přítomností jednoho ze tří stop kodónů. Mnoho součastných článků popisuje ribosomy, které záměrně přechází přes stop signál u některých vybraných mRNA, aby prodloužily vznikající polypeptid a změnily jeho vlastnosti. Tento regulační proces se nazývá programované pročítání stop kodónu. Výzkum této regulace má potenciál se uplatnit i v lékařství, neboť přibližně 15% všech dědičných chorob je způsobeno přítomností takzvaného předčasného terminačního kodónu (PTC), který zastaví translaci a vznikne tak zkrácený nefunkční protein. Mnohé laboratoře již hledají netoxické látky, které by zvyšovaly pročítání předčasného terminačního kodónu. Bohužel k úspěšnému naplnění jejich záměru je třeba identifikovat a porozumět všem faktorům, které tento process ovlivňují. V této disertační práci představujeme jeden takový faktor- eukaryotický iniciační faktor 3 (eIF3). Demonstrujeme jeho schopnost indukovat pročítání terminačních kodónů, které jsou v kontextu nukleotidů nevhodných pro efektivní terminaci. Taktéž jsme vytvořili analýzu "nearcognate" tRNA a ukázali, jak jsou inkorporovány na stop kodón, za kterým následují různé nukleotidy. Díky tomu jsme byli schopni rozšířit...
|
host ::
RSS.